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熒光標記二抗種類繁多,如何選擇?

一般來講,偶聯到二抗上的探針主要有酶(辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP,PAP),熒光基團(FITC, RRX, TR, PE, Rhodamine)和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實驗對于Western Blot和ELISA,最常用的二抗是酶標二抗;而細胞或組織標記實驗(細胞免疫化學,組織免疫化學,流式細胞術)中通常使用熒光標記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測信號,可以使Biotin/Avidin檢測系統。其中熒光素是具有光致熒光特性的染料,熒光染料種類很多,目前常用于熒光標記二抗的主要以下幾種:

  • 異硫氰酸熒光素-Fluorescein Isothiocyanate (FITC)

FITC純品為黃色或橙黃色結晶粉末,易溶于水和酒精溶劑。FITC分子量為389.4,最大吸收光波長為490~495nm,最大發射光波長為520~530nm,呈現明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年,是目前應用最廣泛的熒光素。由于FITC是小分子化合物,每一個抗體可標記幾個FITC分子,IgM通常用小分子的熒光素標記,如FITC、Cy3/5、Texas Red等。FITC熒光二抗主要優點是人眼對黃綠色較為敏感,通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。然而FITC缺點是淬滅快,因此要和抗淬滅劑一起使用。

  • 四甲基異硫氰酸羅丹明-Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate(TRITC),Rhodamine Red-X(RRX), Texas Red(TR)

這些羅丹明的衍生物耦聯基團具有不同的吸收波長 (550, 570, 596nm)和最大發射波長(570, 590, 620nm)。在使用裝有氪氬燈的激光共聚焦掃描顯微鏡作三標記的實驗時,RRX尤其有用,可以和Cy2(或者FITC)和Cy5一起使用,因為RRX的發射波長在Cy2和Cy5中間,而且和這兩者覆蓋都很少氪氬燈激發光為488nm,598nm和647nm,分別Cy2(FITC), RRX和Cy5的理想激發波長因為FITC和PE可以被氬燈的488nm波長激發, 在流式細胞儀中用FITC作雙標,另一種用藻紅蛋白(PE)耦聯基團要比羅丹明好。TRITC為羅丹明的衍生物,呈紫紅色粉末,較穩定最大吸收光波長為 550nm,最大發射光波長為620nm,呈現橙紅色熒光,與FITC的綠色熒光對比鮮明,可配合用于雙重標記或對比染色。因TRITC熒光淬滅慢,也可用于單獨標記染色。

  • 菁類染料-Cyanine dyes(Cy2, Cy3, Cy5)

Cy2耦聯基團激發波長為492nm,發光波長510nm的綠色可見光。Cy2和FITC使用相同的濾波片。由于Cy2比FITC在光下更穩定要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片劑,因為這種抗淬滅劑和Cy2反應,在染色片儲存后會導致熒光微弱和擴散。Cy3和Cy5比其他的熒光團探針要更亮,更穩定,背景更弱。Cy3耦聯基團激發光的最大波長為550nm,最強發射光為570nm。因為激發光和發射光波長很接近TRITC, 在熒光顯微鏡中,可使用和TRITC一樣的濾波片。Cy3在氬光燈(514nm或528nm)下可以被激發出50%的光強,在氦氖燈(543nm)或者汞燈546nm)下則約75%。Cy3可以和熒光素一起作雙標。Cy3還可以和Cy5一起在共聚焦顯微鏡實驗中作多標記。Cy5耦聯基團的激發波長最大650nm,發光波長最大670nm。在氪氬燈(647nm)下它們可被激發出98%的熒光,在氦氖燈下(633nm)為63%。Cy5可以和很多其他的熒光基團一起用在多標記的實驗中。由于它的最大發射波長在670nm,Cy5很難用裸眼觀察,而且不能用汞燈作理想的激發。通常觀察Cy5時采用具有合適激發光和遠紅外檢測器的共聚焦顯微鏡在水相封片劑中應當加入抗淬滅劑。使用傳統的表面熒光顯微鏡時,不推薦使用Cy5。

注:由于觀察熒光需要一定波長的激發光,必須根據實驗室已有的儀器可發光的波段進行選擇。另外注意多標記中對探針色彩區分程度的要求例如,若丹明紅-X (RRX)和德克薩斯紅(TR)熒光素的區別就比四甲基若丹明(TRITC)或者Cy3的區別明顯。如果對靈敏度有更高的要求,則Cy3和Cy5就比其他的熒光團探針要亮。

 

西美杰代理的全球知名二抗和底物生產廠商LGC·Seracare·KPL提供豐富的熒光標記二抗,可檢測抗人、大鼠、小鼠、豬、驢、綿羊、山羊、小雞、馬、兔、倉鼠、狗、牛,以及多種細菌類等物種;另外,還有IgG、IgA、IgM以及IgG(Fc)、IgG(ab’)2等不同類型抗體。小編下面匯總了部分常用熒光二抗:

FITC

TRITC

Cy3

Cy5

抗人

5230-0288

5230-0288

-

5230-0370

抗小鼠

5230-0427

5230-0336

5230-0364

5230-0376

抗兔

5230-0298

5230-0332

5230-0359

5230-0372

抗山羊

5230-0294

-

5230-0358

5230-0371

抗綿羊

5230-0324

-

-

-

抗雞

5230-0325

-

-

5230-0379

抗鴨

5230-0326

-

-

-

抗狗

5230-0314

-

-

-

抗貓

5230-0317

-

-

-

鏈霉親和素

5270-0028

-

5270-0022

-

注:表格數字部分為產品貨號


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